高湿环境诱导大鼠肝脏细胞凋亡的实验研究

西南军医２０１５年７月第１７卷第４期Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＭｉｌｉｔａｒｙ　Ｓｕｒｇｅｏｎｉｎ　ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＣｈｉｎａ，Ｖｏ１．１７，Ｎｏ．４，　ｕｌ　２０１５　・３７５・　高湿环境诱导大鼠肝脏细胞凋亡的实验研究　宋富强，郭文琼，郭　鑫，李　昆，冯亚星，李［摘要］　目的方法薇，呼永河　观察高湿环境下大鼠肝脏组织损伤及细胞凋亡情况，探讨高湿环境对大鼠肝脏的影响。　３２只ＳＤ大鼠随机分为两组，高湿２０ｄ组与对照组，每组ｌ６只大鼠。采用人工气候箱模拟高湿环境，条件　设置为温度２５。Ｃ、相对湿度（９０％土２％）ＲＨ。高湿２０ｄ组大鼠每天置于气候箱中１０ｈ，其余时间与对照组饲养于　相同环境，温度２５。Ｃ，相对湿度（４５％～５０％）ＲＨ，时间为２０ｄ。动物模型制作完成后，取肝脏组织行免疫组化及　Ｗｅｓｔｅｒｎ实验观察两组肝脏细胞凋亡情况。结果　高湿组Ｔｕｎｅｌ法原位标记可观察到肝脏细胞凋亡，同时活化　的Ｃａｓｐａｓｅ．３酶表达显著升高。结论　高湿环境可诱导大鼠肝脏细胞凋亡的发生，凋亡的关键酶Ｃａｓｐａｓｅ．３在　其中扮演了重要角色，为下一步研究高湿诱导细胞凋亡的具体机制提供了实验基础。　［关键词］　高湿；细胞凋亡；ＴＵＮＥＬ；半胱氨酸天冬氨酸酶．３　［中图分类号］　Ｒ　３３２　［文章编号］１６７２．７１９３（２０１５）０４—０３７５．０３　［文献标识码］Ａ　Ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２．７１９３．２０１５．０４．００６　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｒａｔ　Ｌｉｖｅｒ　Ｃｅｌｌｓ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎ　Ｈｉｇｈ　Ｈｕｍｉｄｉｔｙ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｓｏｎｇ　Ｆｕｑｉａｎｇ，Ｇｕｏ　Ｗｅｎｑｉｏｎｇ，Ｇｕｏ　Ｘｉｎ，Ｌｉ　Ｋｕｎ，Ｆｅｎｇ　Ｙａｘｉｎｇ，Ｌｉ　Ｗｅｉ，Ｈｕ　Ｙｏｎｇｈｅ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ／Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｈｉｇｈ　Ｈｕｍｉｄｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＰＬＡ，Ｃｈｅｎｇｄｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖ—　ｉｎｃｅ，６１００８３，Ｒ　Ｒ．Ｃｈｉｎａ　ＡＢＳＴＲＡＣＴ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｄａｍａｇｅ　ｏｆ　ｒａｔ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｒａｔ　ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｈｉｇｈ　ｈｕｍｉｄｉｙ　ｔｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ＳＯ　ａｓ　ｔｏ　ｄｉｓｃｕｓｓ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｈｕｍｉｄｉｙ　ｏｎ　ｔｒａｔ　ｌｉｖｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　３２　ＳＤ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　２　ｇｒｏｕｐｓ：ｈｉｇｈ　ｈｕｍｉｄｉｙ　ｇｒｏｕｐ　ｔａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，１　６　ｉｎ　ｅａｃｈ；ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｌｉｍａｔｅ　ｂｏｘ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｉｎ　ｉｍｉｔａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｈｕｍｉｄｉｔｙ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　２５℃ａｎｄ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｈｕｍｉｄｉｙ　ｏｆ　ｔ９０￣２％ＲＨ：ｒａｔｓ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｆｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　２５℃ａｎｄ　ｒｅｌａ—　ｔｉｖｅ　ｈｕｍｉｄｉｔｙ　ｏｆ　４５％一５０％ＲＨ　ｆｏｒ　２０　ｄａｙｓ，ｄｕｒｉｎｇ　ｗｈｉｃｈ，ｒａｔｓ　ｉｎ　ｈｉｇｈ　ｈｕｍｉｄｉｙ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｋｅｐｔ　ｉｔｎ　ｔｈｅ　ａｒｔｉｉｃｉｆａｌ　ｃｌｉｍａｔｅ　ｂｏｘ　ｆｏｒ　１　０　ｈｏｕｒｓ　ｅｖｅｒｙ　ｄａｙ；ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔｕｄｙ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｏｌｔ　ｗｅｒｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｉｎ　ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｒａｔ　ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｈｉ【ｇｈ　ｈｕｍｉｄｉｙ　ｇｔｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ＴＵＮＥＬ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ　Ｃａｓｐａｓｅ一３　ｗａｓ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｈｉｇｈ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｈｉｇｈ　ｈｕｍｉｄｉｙ　ｅｎｖｉｔｒｏｎｍｅｎｔ　ｍａｙ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｒａｔ　ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｃａｓｐａｓｅ一３　ａｓ　ｔｈｅ　ｋｅｙ　ｅｎｚｙｍｅ　ｐｌａｙｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｐｏｐ—　ｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ｈｉｇｈ　ｈｕｍｉｄｉｙ　ｔｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．　ＫＥＹＷＯＲＤＳ　ｈｉｇｈ　ｈｕｍｉｄｉｔｙ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ＴＵＮＥＬ　Ｃａｓｐａｓｅ一３　高湿作为一种特殊的环境气候条件可诱发机体　产生各种病理生理的改变［ｉ－３］，本实验组前期发现高　湿环境可诱导大鼠肝功的紊乱，影响大鼠肝脏的正常　良好，平均体质量２００～２２０ｇ，由四川省医学科学院实　验动物中心提供［许可证号：ＳＣＸＫ（川）２００４］，随机　分为两组，高湿２０ｄ组与对照组，每组１６只大鼠。采　用人工气候箱模拟高湿环境，设置条件：温度为　２５。Ｃ、相对湿度（ｍ－Ｉ）为（９０士２）％，高湿组：１０ｈ／ｄ置于　气候箱中，其余时间与对照组饲养于相同环境（温度　２５。Ｃ，相对湿度（４５％～５０％）ＲＨ，共２０ｄ。　代谢　，高湿是否通过诱导细胞凋亡从而导致肝脏的　损伤还未见报道。本实验通过原位组织标记法观察　高湿对肝脏组织细胞凋亡的影响，同时观测细胞凋亡　关键酶半胱氨酸天冬氨酸酶一３（Ｃａｓｐａｓｅ．３）的表达情　况，探讨高湿诱导肝细胞凋亡的可能途径，为进一步　研究高湿环境对人体器官组织的影响提供实验基础。　１材料与方法　１．２仪器及试剂ＲＸＺ一１　０００Ａ—ｚｌ多段编程人工气候　箱（Ｒｘｚ．１０００Ａ，中国宁波江南仪器厂），Ｓｏｒｖｅｌｌ　ＳＴ１６Ｒ　台式冷冻离心机，ＳＡＮＹＯ　ＭＤＦ．Ｕ５３Ｖ一８Ｏ。Ｃ低温冰　箱，Ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ　ＥＳ自动组织脱水机，ＨｉｓｔｏＳｔａｒ组织包埋　机，Ｆｉｎｅｓｓｅ　Ｅ＋石蜡切片机，Ｒｏｃｈｅ凋亡检测试剂盒，　昆、　１．１动物模型３２只ＳＰＦ级雄性ＳＤ大鼠，健康状况　作者单位：６１００８３成都，中国人民成都军区总医院实验医学中心微免科；高湿医学全军重点实验室（宋富强、郭　鑫、李冯亚星、李薇、呼永河）；成都，成都医学院护理学院（郭文琼）　通信作者：呼永河，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｕｙｏｎｇｈｅ＠ｖｉｐ．１　２６．ｃｏｍ　西南军医２０１５年７ＹＪ第１７卷第生期　！　些　墨　塑！　！：　！！　：　：　！　！　・３７７・　亡。研究表明　Ｃａｓｐａｓｅ一３在肝细胞损伤及凋亡的　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｌｅｖａｔｅｄ　Ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ　Ｂａｘｌ，２　ｌＪｊ．ＪＮｕｔｒ，　２００８，１３８（１０）：１８６６—１８７１．　过程中扮演着重要角色，参与了肝细胞凋亡的进程。　本实验中通过免疫印迹方法，可见活化的Ｃａｓｐａｓｅ－３　［６］郭晓红，刘立新．ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ流式细胞分析法和ＴＵＮＥＬ　法检测肝细胞凋亡的对比研究［Ｊ］．山西医科大学学报，　２００８，３９（５）：４７６．４７９．　（１７ｋＤ）的表达较对照组显著升高，表明高湿环境下　大鼠肝脏细胞发生凋亡，Ｃａｓｐａｓｅ．３蛋白酶参与了其　中过程。　［７］佟俊杰，苗清，王志国，等．ＴＵＮＥＬ法和ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ　流式细胞分析法检测成纤维细胞凋亡的对比研究［Ｊ］．　口腔医学，２０１４，３４（１）：１２．１５．　综上所述，本研究观察到高湿环境下大鼠肝脏细　胞发生病理改变，细胞凋亡扮演了重要角色，诱导凋　亡的关键酶Ｃａｓｐａｓｅ一３参与了凋亡的进程，为下一步　深入研究高湿环境诱导细胞凋亡的具体机制提供了　实验基础。　【参考文献】　［１］陈刚，张六通．外湿模型大鼠胃肠激素变化的研究［Ｊ］．中　国现代医生，２００７，４５（１０）：８７．８８．　［８］赵瑞杰，李引乾，王会，等．Ｃａｓｐａｓｅ家族与细胞凋亡的关　系［Ｊ］．中国畜牧杂志，２０１０，４６（１７）：７３—７７．　［９］　刘岩，张虹，金雪，等．荷包牡丹碱诱导人肺腺癌细胞　Ａ５４９凋亡及其机制初探［Ｊ］．中国药学杂志，２０１１，４６　（２４）：１８９０．１８９３．　［１０］张翠，佟倩倩，高佳雪，等．水苏碱对肾纤维化大鼠肾组　织ＣＨＯＰ、ｃａｓｐａｓｅ一３作用［Ｊ］．哈尔滨商业大学学报（自然　科学版），２０１４，３０（１）：７．１３．　［２］胡娟，林薇，呼永河，等．高湿环境中不同性别人群血清　ＴＫ．１水平差异性的研究［Ｊ］．国际检验医学杂志，２０１３，　３４（２３）：３１２９　３１３０．　［１１］谢汝佳，韩冰，杨婷，等．肝纤维化过程中ｃａｌｐａｉｎ２与ｃａｓ．　ｐａｓｅ一３表达变化及意义［Ｊ］．中国公共卫生，２０１４，３０（１）：　８２—８５．　［３］郭鑫，王超，李薇，等．高湿环境对大鼠免疫功能的影响　［１　２］胡伟，丁伟．肝细胞癌ｓｕｒｖｉｖｉｎ和ｃａｓｐａｓｅ．３的表达及其与　预后的关系［Ｊ］．实用肿瘤杂志，２０１０，２５（３）：２６３．２６７．　［１３］郭晓东，李志伟，杨美，等．肝癌组织中凋亡因子Ｆａｓ、　ＦａｓＬ及ｃａｓｐａｓｅ．３的表达及意义［Ｊ］．肝脏，２０１４，１９（４）：　２５０．２５２．　［Ｊ］．中国应用生理学杂志，２０１４，３０（１）：８９．９２．　［４］李昆，郭鑫，杨芸，等．高湿环境对大鼠肝脏异柠檬酸脱氢　酶及ｃｃ．酮戊二酸脱氢酶的影响［Ｊ］．第三军医大学学报，　２０１３．３５（２３）：２５９５－２５９６．　［５　Ｊ　Ｗａｎｇ　Ａｕｓｍａｎ　ＬＭ，Ｒｕｓｓｅｌｌ　ＲＭ，ｅｔ　ａＬ　Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　Ａｐｏｐ－　ｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｈｉ【ｇｈ－Ｆａｔ　Ｄｉｅｔ—Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉ—　ｔｉｓ　ｉｎ　Ｒａｔｓ　Ｉｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃ．Ｊｕｎ　ＮＨ２．Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｋｉｎａｓｅ　（收稿日期：２０１５．０２．１１）　（责任编辑：杨惠文）　南充市２７０４例肺癌病理资料分析　张桂萍，廖［摘要］　目的颖，李祖茂　探讨南充市人群肺癌的发病趋势、组织学类型的构成情况，为肺癌的防治工作提供科学依　原发性肺癌病例２７０４例，其中男性２０２３例，女性６８１　据。方法　选取２００１—２０１２年川北医学院附属医院通过病理活检诊断的肺癌病例，运用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ（２００７　版））和ＳＰＳＳ１７．０软件进行数据录入和统计分析。结果例，男女之比为２．９７：１。１２年期间发病人数总体呈上升趋势，但男女之比呈逐渐降低趋势（Ｐ＜Ｏ．０５）。男女肺癌　基金项目：四川Ｉ省教育厅科研基金（０８ｚｂ０９６）　作者单位：６３７０００四川南充，）ｌｌ￣ｔ医学院病理学教研室。附属医院病理科（张桂萍、廖通信作者：李祖茂，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｚｕｍａｏ＠１　６３．ｔｏｍ　颖、李祖茂）